细胞工程实验总结 细胞工程实验设计优质

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细胞工程实验总结 细胞工程实验设计优质
时间:2023-04-27 15:41:03     小编:zdfb

总结是对过去一定时期的工作、学习或思想情况进行回顾、分析,并做出客观评价的书面材料,它有助于我们寻找工作和事物发展的规律,从而掌握并运用这些规律,是时候写一份总结了。优秀的总结都具备一些什么特点呢?又该怎么写呢?下面是小编整理的个人今后的总结范文,欢迎阅读分享,希望对大家有所帮助。

细胞工程实验总结 细胞工程实验设计篇一

2.了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。

3.掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法。

[ 实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。

差速离心法(differential centrifugation)是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心,较大颗粒先在低速离心时沉淀,再用高速离心上清液中的小颗粒物质,从而达到逐级分离细胞器的目的。

细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。

分级分离方法有两种,即:差速离心法和密度梯度离心法。

细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和替他微体、核糖体和大分子物质。

线粒体内膜上分布细胞色素氧化酶,能使詹纳斯绿 b 燃料保持在氧化状态呈现蓝绿色,而胞质中的颜料被还原成无色。

[ 实验用品] 1.器具:匀浆器、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml ep 管、载玻片、10 ml 滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml 烧杯。

2.材料:动物肝脏。

3.试剂:生理盐水、pbs、0.25 mol/l 的蔗糖溶液、0.34 mol/l 的蔗糖溶液、0.88 mol/l 的蔗糖溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰。

4.甲基绿-派洛宁染液:

0.2mol/l 醋酸缓冲液(ph4.8):冰醋酸 1.2ml,加蒸馏水至 100ml;醋酸钠 2.72g 溶于 100ml 蒸馏水中;使用时两液按 2:3 比例混合.a液:5%派洛宁水溶液4ml、2%甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml;b液:0.2mol/l。醋酸缓冲液(ph4.8)16 ml。使用时临时将 a 液与 b 液混合(5:2)。

5.)中性红-詹纳斯绿 b 染液:

a: 将 3 滴詹纳斯绿 b 饱和水溶液(溶解度 5.18%)加到 5ml 无水乙醇中,然后再加入 1ml 1:15000 中性红溶液(中性红 10mg 溶于

150ml 水中),瓶子用黑纸包好,4℃冰箱保存。

[ 实验步骤] 1.组织匀浆制备 肝脏用预冷的生理盐水洗净血污,用滤纸吸干。

称取约 1 g 左右的肝组织,用预冷的 0.25 mol/l 的蔗糖溶液冲洗数次,剪碎。以预冷的 0.25 mol/l 的蔗糖溶液 4.5ml 悬浮剪碎的组织,移入匀浆器内,在冰浴条件下匀浆(蔗糖溶液分数次加入)。(0.25 mol/l 的蔗糖溶液使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下,使得细胞更容易破碎,匀浆彻底)2.细胞器的分级分离 2.1 细胞核的分离:

将组织匀浆分装到 1.5ml 离心管中,3000rpm,离心 10min,沉淀为细胞核及质膜碎片。(上清液留作线粒体分离)2.2沉淀用1ml 0.25mol/l蔗糖溶液洗涤离心2次,每次4000r/min离心10min; 2.3 将沉淀用 500μl 0.34mol/l 蔗糖溶液悬浮,然后在悬液下轻轻加入0.88mol/l 蔗糖溶液 400μl,尽量使溶液分层,5000r/min 离心 15-20min; 2.4 用 pbs 溶液悬浮——涂片——干燥——95%乙醇固定(5min)——甲基绿-派洛宁染色 15-20min——放入丙酮分离 30s——蒸馏水漂洗——吸干镜检。

(2)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以 10000g 离心 10 min,弃去上清。沉淀用预冷的 0.25 mol/l 的蔗糖溶液 1ml 重悬后,10000g 离心 10 min,取沉淀。

(3)线粒体的鉴定 于洁净载玻片上滴 1 滴中性红-詹纳斯绿 b 染液,用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中,染色 5-10 min,盖上盖玻片,镜检。

[ 结果与分析] 光学显微镜下观察,可看到富集分离的细胞核,细胞核呈圆球形,核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁,外围的物质被染成蓝绿色;线粒体经詹纳斯绿 b染色呈蓝绿色,呈棒状或哑铃状。

[ 注意事项] 1.组织匀浆时,既要尽可能使细胞完全破碎,又要尽量快速。

2.在细胞器分离过程中,所有操作应尽可能在低温下进行。

3.实验过程应注意保持细胞器的完整性,避免操作过于剧烈。

[ 思考题] 1. 简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤? 2.实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度?

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